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常用蛋白質濃度測定方法匯總


 蛋白質是細胞中最重要的含氮生物大分子之一,承擔著各種生物功能。蛋白質的定量分析是蛋白質構造分析的基礎。目前常用的蛋白測量的方法主要有BCA法、考馬斯亮藍法(Bradford)和Lowry法等。


  BCA法  

 原理

 在堿性環境下蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu1+(biuret reaction)。BCA與Cu1+結合形成穩定的紫藍色復合物,在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質濃度成正比,據此可測定蛋白質濃度。


實驗步驟

1.按試劑盒說明書配置BCA工作液;

2.完全溶解蛋白質標準品,加到96孔板的蛋白標準品孔中,按照說明書要求對標品進行梯度稀釋,加入BCA工作液,用酶標儀測定其吸光度;

3.以樣品濃度為X軸,吸光度為Y軸,繪制標準曲線;

4.待測樣品中加入BCA工作液,測定吸光度,帶入標準曲線中,計算樣品濃度。

  與Lowery法相比,BCA蛋白測定方法靈敏度高,操作簡單,試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱佳,并且受干擾物質影響小。與Bradford法相比,BCA法的顯著優點是不受去垢劑的影響。


  考馬斯亮藍法(Bradford)法  

 原理

 考馬斯亮藍G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色,最大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合后變為青色,蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用于蛋白質的定量測定,是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。


實驗步驟

1.按試劑盒說明書配置Bradford染液;

2.完全溶解蛋白質標準品,加到96孔板的蛋白標準品孔中,按照說明書要求對標品進行梯度稀釋,加入染液和染料結合液后,用酶標儀測定其吸光度;

3.以標品濃度為X軸,吸光度為Y軸,繪制標準曲線;

4.各孔中加入染液和染料結合液,測定樣品吸光度,帶入標準曲線中,計算樣品濃度。

 Bradford法試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質含量,測定蛋白質濃度范圍為0~1 000μg/mL,最小可測2.5μg/mL蛋白質。


   斐林—酚試劑(Lowry)法   

 原理

 斐林(Folin)-酚試劑法結合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質的反應,其中包括兩步反應:第一步是在堿性條件下,與銅試劑作用生成蛋白質-銅絡合物;第二步是此絡合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原,生成磷鉬藍和磷鎢藍的深藍色混合物,顏色深淺與蛋白含量成正相關,在650nm波長下有最大光吸收。


 實驗步驟

 與上述兩種方法大致相同

 LORRY法靈敏度高,重復性好,適于5~l00μg蛋白質的定量,耗時長,操作要嚴格計時,在實驗中要特別注意排除還原物質、檸檬酸等的干擾作用才能得到最準確的實驗結果。

 這幾種方法共同點在于,都需要繪制標準曲線,而標準曲線及待測樣品往往數量較多,為了縮短實驗耗時,保證測量準確性,可使用酶標儀對吸光度進行測定。


 AMR-100酶標儀

AMR-100酶標儀

 AMR-100酶標儀是一款基于濾光片的高品質光吸收酶標儀,波長范圍340nm~750nm,適合科研和臨床的應用。適用96孔板,可滿足不同通量的要求。7英寸觸屏液晶顯示,易于使用,不需操作鍵盤,數據和程序可保存在儀器內,或者通過U盤導出。讀板速度快,能實現快速測量,提供準確性高,重現性好的測量結果。是實驗室酶標儀的理想選擇。

 性能指標
 顯示 7英寸彩色觸摸屏,分辨率為800*480像素
 光源 鹵鎢燈,壽命可達2000h
 波長范圍 340-750nm,覆蓋整個可見光波長
 濾光片 8片濾光片輪,標配4塊濾光片:405,450,492,630nm,另可選配340nm-750nm波長濾光片
 濾光片帶寬 ±3nm
 讀數范圍 0-4.000Abs
 線性范圍

0-2.000A時≤±1% ;
2.000-4.000A時≤±2% 

 分辨率 0.001Abs
 準確性(405nm) ±1% (0-3Abs)
 ±2%(3-4Abs)
 精確性(405nm)

CV≤0.2%(0-3Abs)
CV≤1.0%(3-4Abs)標準測量模式

測量速度<6S 96孔板整板檢測
用戶界面內置軟件
操作顯示觸屏輸入,液晶顯示全板信息,可外接鍵盤鼠標
內存可存儲200個測量程序和10萬個測量結果(96孔板)
接口3個USB接口,分別用于連接電腦,打印機和U盤
電源AC100-240V,50-60Hz


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